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    細胞傳代實驗介紹及方法

    添加日期:2014年10月24日 關鍵字: 點擊次數:782 次

    導讀:細胞傳代實驗介紹及方法

      根據細胞生長的恃點,傳代方法有3種:懸浮生長細胞傳代、半懸浮生長細胞傳代、貼壁生長細胞傳代。

      實驗方法:細胞培養技術消化法

      實驗方法原理:培養細胞傳代根據不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打傳代。

      實驗材料:細胞,試劑、試劑盒,D-Hanks液,小牛血清,RPMI1640,雙抗,胰蛋白酶,EDTA NHCl NaHCO3

      儀器、耗材:

      凈化工作臺,離心機,恒溫水浴箱,冰箱,倒置相差顯微鏡,培養箱,吸管,玻璃瓶,培養瓶,廢液缸,吸頭,槍頭,膠塞 ,離心管,量加樣槍,紅血球計數板

      實驗步驟:

      1. 貼壁細胞的消化法傳代:

      吸除或倒掉瓶內舊培養液。

      D-Hanks液洗2~3次。

      輕輕搖動培養瓶,使消化液流遍所有細胞表面。

      消化在37℃或室溫25℃以上環境下進行。

      消化2~5 min 后把培養瓶放置顯微鏡下進行觀察,發現胞質回縮,細胞間隙增大后,應立即終止消化。

      吸除或倒掉消化液,如用EDTA消化,需加Hanks液數毫升,輕輕轉動培養瓶把殘留消化液沖掉。

      再加培養液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養液,終止消化。

      用彎頭吸管,吸取瓶內培養液,反復吹打瓶壁細胞,吹打過程要順序進行。

      從培養瓶底部一邊開始到另一邊結束,以確保所有底部都被吹到,使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。

      計數,分別接種在新的培養瓶內。

      2. 懸浮細胞的傳代:懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代,或直接傳代。

      離心傳代法:

      將細胞連同培養液一并轉移到15 ml 離心管內。

      離心800~1000 rpm,5 min。

      棄去上清,加新的培養液到離心管內,用吸管吹打形成細胞懸液。

      計數,分別接種在新的培養瓶內。

      直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后,將上清液吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

      3. 部分貼壁細胞的傳代

      部分貼壁不牢的細胞,如Hela細胞等,不經消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來,而進行傳代。

      對絕大部分貼壁生長的細胞,因直接吹打對細胞損傷較大,細胞常有較大數量的丟失,因而需消化后,才能吹打傳代。

      注意事項:

      1. 胰蛋白酶要預溫,溫度37℃左右為宜℃。

      2. 離心轉速要合適,轉速過低,不能有效分離細胞,離心速度過大,時間過長,會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。

      3. 要定時觀察細胞,發現污染,應及時處理。

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