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    實驗技術

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    蛋白質的表達、分離、純化實驗

    添加日期:2018年03月19日 關鍵字: 點擊次數:844 次

    導讀:蛋白質的表達、分離、純化實驗

      實驗方法原理:

      攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中,在 37℃,IPTG誘導下,超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素?;D移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質加以提純,實為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

      實驗材料:大腸桿菌BL21

      試劑、試劑盒:LB液體培養基,氨芐青霉素,Washing Buffer,Elution Buffer IPTG,蒸餾水,胰蛋白胨,酵母粉,氯化鈉

      儀器、耗材:搖床,離心機,層析柱,離心管,移液槍,槍頭盒,燒杯,玻璃棒

      實驗步驟:

      試劑準備

      1.  LB液體培養基:Trytone 10 g, yeast extract 5 g,NaCl 10 g,用蒸餾水配至1000 mL。

      2.  氨芐青霉素:100 mg/mL。

      3.  上樣緩沖液:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8M Urea,10 mM  2-ME,pH8.0。

      4.  Washing Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8 M Urea,pH6.3。

      5.   Elution Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mMTris,8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0。

      6.   IPTG:100mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾,-20℃保存。

      二、獲得目的基因

      1.  通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

      2.  通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

      三、構建重組表達載體

      1.  載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

      2.  PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

      四、獲得含重組表達質粒的表達菌種

      1.  將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

      2.  測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

      3.  以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

      五、氯霉素?;D移酶重組蛋白的誘導

      1.   接種含有重組氯霉素?;D移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養基中(含100 ug/mL 氨芐青霉素),37℃震蕩培養過夜。

      2.  按1∶50或1:100的比例稀釋過夜菌,一般轉接1 mL過夜培養物于100 mL(含100 ug/mL 氨芐青霉素)LB液體培養基中,37℃震蕩培養至OD600 = 0.6 - 0.8(0.6,大約需3 h)。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。

      3.   對照組不加誘導劑,實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l,37℃繼續培養1-3h。

      4.  12 000 rpm 離心10 min,棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

      六、氯霉素?;D移酶重組蛋白的分離、純化

      1.  NTA層析柱的準備:在層析柱中加入1 mL NTA介質,并分別用8 mL 去離子水,8 mL上樣緩沖液洗滌。

      2.  重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5 mL上樣緩沖液, 用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min,4℃ 12000 rpm 離心 30 min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。

      3.  上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。

      4.  洗脫雜蛋白:用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液,約3-4 h,取10 ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。

      5.  洗脫目標蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 級分,分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。

      注意事項:

      1.  選擇表達載體時,要根據所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化,可選擇融合表達;如為獲得天然蛋白,可選擇非融合表達。

      2.  融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時,對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發生干擾。

      3.  菌液OD值要小于1,否則細胞太濃太老,不易破碎,且質粒易丟失。

      4.  誘導時間做一個梯度,不同蛋白誘導時間需摸索。

      5.  誘導溫度適當摸索:25、30℃。

      6.  IPTG濃度:一般在1 mM 以內,可適當摸索。

      7.  超聲條件可視實際情況改變,只要使菌體裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠。

      

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